適用機(jī)型（包括但不限于）：

◆ ABl QuantStudio 3 qPCR 儀

◆ 羅氏LC96 Real-Time PCR System

◆ AB1 7500 Real-Time PCR System

◆ 伯樂(lè) CFX Opus96 Real-Time PCR System

◆ 鯤鵬ArchimedTM X Real-Time PCR System

需要準(zhǔn)備的耗材與設(shè)備：

◆熒光定量 PCR 儀

◆ 1000uL，100uL，10uL移液槍

◆ 1.5mL 無(wú)菌離心管

◆ 1000μL，100uL，10μL無(wú)菌低吸附帶濾芯吸頭

◆ 無(wú)菌無(wú)酶八聯(lián)管或 96 孔 qPCR 板

試驗(yàn)流程：

一、 qPCR 反應(yīng)液的制備和加樣

1、根據(jù)所需檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品數(shù)量(一般做3 組復(fù)孔)，計(jì)算反應(yīng)所需孔數(shù):
反應(yīng)孔數(shù)=(6 組參考品+1個(gè)無(wú)模板對(duì)照 NTC+待測(cè)樣品)x3
2、根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 Vero qPCR MIX 總量:
Vero qPCRMIX=(反應(yīng)孔數(shù)+2或3)x20uL(2 或3為操作損失量)
3、將所用試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制Vero qPCR MIX：

4.將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣(總體積 30uL):

二、 qPCR 反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

以 BIO-RAD 公司 CFX96 qPCR 儀為例。

1、設(shè)置反應(yīng)程序:

2、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板，點(diǎn)擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM;在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Unknow，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 Vero;輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及 Sample Name。

在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 Vero;輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及SampleName。并且分別在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration 一欄賦值為 300000、30000、3000、300、30、3(單位為fg/uL)。

3、點(diǎn)擊 Run 界面的“Start Run"按鈕進(jìn)行 PCR 測(cè)定。

程序 Stage3 中 60°C 30s處設(shè)置為熒光收集

三、 qPCR 結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、NCS、待測(cè)樣本的檢測(cè)值，單位為fg/μL。
3. 陰性對(duì)照 NTC和 NCS 的 CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最-低濃度的 CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒已通過(guò)穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無(wú)需分裝。

2. 陰性樣品和陽(yáng)性樣品（參考品和待測(cè)樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。

3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染，避免長(zhǎng)時(shí)開(kāi)蓋。

4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。

5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。

6. 只有嚴(yán)格遵守說(shuō)明書(shū)的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測(cè)效果。

7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。

9. 公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

專業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo)，幫助用戶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率。

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